La variante de despegue corto/aterrizaje vertical (STOVL) del F-35 es el F-35B, el primer avión supersónico STOVL de sigilo. Está diseñado para operar desde bases austeras y una gama de barcos con capacidad aérea cerca de las zonas de combate de primera línea. También puede despegar y aterrizar convencionalmente desde pistas más largas en las principales bases. El avión F-35B de la Infantería de Marina de los Estados Unidos alcanzó la capacidad operativa inicial (COI) el 31 de julio de 2015 y, a partir de enero de 2017, un escuadrón de F-35B tiene su sede permanente en el MCAS Iwakuni, Japón.

La operación STOVL del F-35B es posible a través del sistema patentado de propulsión LiftFan® impulsado por un motor Rolls-Royce que puede girar 90 grados cuando está en modo de despegue corto/aterrizaje vertical. Debido a LiftFan®, la variante STOVL tiene un compartimiento de armas interno más pequeño y menos capacidad de combustible interna que el F-35A. Aunque puede ser reabastecido en vuelo.  

Los aviones F-35B se han entregado a los marines norteamericanos y a Reino Unido. Los aviones STOVL de los Estados Unidos están estacionados en la primera base operativa del F-35B, en la Estación Aérea de la Infantería de Marina Yuma, Arizona , y en la Estación Aérea de la Infantería de Marina Beaufort, Carolina del Sur, donde se lleva a cabo el entrenamiento para volar el F-35B. Los primeros F-35B del Reino Unido están ubicados en el Escuadrón 17 de la RAF, estacionado momentáneamente en Edwards AFB, California, donde se realizan las pruebas operativas. La Fuerza Aérea italiana también operará el F-35B.

La búsqueda para crear un avión de combate capaz de despegar y aterrizar en espacios confinados ha sido una búsqueda de décadas en ambos lados del Atlántico. Ya en 1954, Lockheed Martin estaba ocupado diseñando cazas experimentales de «ascenso vertical», que pronto allanaron el camino para aviones de aterrizaje vertical como el británico Harrier.

Pero, a diferencia del Harrier, el F-35B y su sistema de despegue corto y aterrizaje vertical (STOVL) ofrecen tanto aterrizaje vertical como velocidad supersónica de largo alcance en una unidad, creando un avión de combate sigiloso y veloz capaz de transportar armamento avanzado.

Usando la energía generada por el motor único del F-35, un tubo de chorro giratorio capaz de girar 95 grados en 2,5 segundos redirige el empuje del motor hacia abajo, mientras que los ventiladores de elevación adicionales debajo de la cabina y las alas se combinan para producir 40,000 libras de empuje vertical.

Respecto al pilotaje de la aeronave los pilotos de prueba señalarón: «Tenías que ser un pulpo para volar un Harrier«. En un F-35B, otro dijo: «Es como magia«.

Apenas tres meses después de su primer aterrizaje vertical, un F-35B rompió la barrera del sonido, convirtiéndose en el primer avión STOVL en superar el Mach 1. Para octubre de 2011, un F-35B estaba realizando sus primeros aterrizajes verticales en el mar, descendiendo hacia la cubierta de un pequeño barco de asalto anfibio de la Infantería de Marina, estableciendo una serie de pruebas de armas en 2012.